复习资料：2019年1月自考《生物制药技术》重点串讲九

91．肿瘤坏死因子生物学活性：（1）抗肿瘤活性；①TNF直接抗肿瘤细胞的作用；②TNF在体内的抗肿瘤作用；（2）抗炎症活性；（3）促凝血活性；（4）对脂肪细胞合成脂蛋白脂酶（LPL）和LPL活性的抑制作用；（5）促进细胞因子分泌；（6）免疫调节作用（7）抗病毒、抗细菌、抗真菌作用；（8）热原质作用；（9）参与骨质重吸收。
92．IL-13的作用：（1）强烈报制外周血单核细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8和gro-β；（2）能抑制细胞培养分化的巨噬细胞产生HIV，并能抑制体外HIV复制；（3）较小程度直接作用于大颗粒淋巴细胞（LGL）合成IEN-y，并与适量和亚适量的IL-2的协同作用；（4）它能影响B淋巴细胞，增强其增殖并能表达CD23表面抗原；（5）有抗炎作用（败血性休克和风湿性关节炎）并刺激体液免疫应答；（6）增强由IL-2诱导产生的细胞因子激活的杀伤细胞活性。
93．基因工程重组细胞因子的制备质控：(1)详细记录表达载体和宿主细胞，包括克隆基因的来源和鉴定，以及表达载体的构建、遗传学和结构等，此外还要介绍载体引入宿主细胞的方法，和载体在宿主细胞中的状况； (2)应有详细的插入基因和表达载体侧翼调控区核苷酸序列的资料；(3)在生产中启动和控制有关基因的表达方法要有详细记录；(4)产品纯化方法要有明确详尽记载，如采用单抗法和层析法，要采取适当措施，保证这些单抗或其它潜在污染物不损害终产品的质量和安全性。
94．细胞因子的分子生物学测定法：
 目前采用的分子生物学技术有RNA印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交和多聚酶链式反应。均为通过检测相应的mRNA量、推算出几量的方法。多聚酶链式反应(PCR)是目前检测几最敏感的方法，尤其适用于极微量的标本，或仅有极少数细胞才能表达几基因，或几基因以低水平表达的标本，目前已可作半定量分析，
95．干扰素的定义及含义：
 (1)干扰素的定义：干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成；
 (2)目前认为，干扰素是一种类似多肽激素的细胞功能的调节物质，是一种细胞素，这一定义的含义如下：①干扰素必须是一种蛋白质，它对蛋白酶类是敏感的，而对DNA酶或RNA酶却有抵抗；天然干扰素是一种糖蛋白，采用DNA重组技术由大肠杆菌表达的人干扰素多肽不带糖分子； ②这种蛋白质的结构基因与调节基因广泛地存在于脊椎动物以上的细胞内，在一般生理状态下，细胞的干扰素基因呈静止状态，只有在特定诱生剂的作用下，细胞的干扰素基因才活动，转录合成相应的mRNA，进而转译出具有种属特异性的干扰素蛋白； ③干扰素本身并不能直接灭活病毒，干扰素作用于细胞后，使后者又产生多种其它蛋白质(抗病毒蛋白)，从而阻断病毒的繁殖； ④干扰素必须具有广谱的抗病毒活性，如果某一种抗病毒物质仅对特定的病毒有作用，就不能称为干扰素。
96．人淋巴细胞几—2的制备产物检定方法：
 (1)活性检定：采用CTLL细胞株的³H掺人法进行活性测定，比活性必须在106IU／mg以上；
 (2)纯度检定：①SDS—PAGE检测，用银染色，在15KD处呈单一条带，后扫描测得几—2条带占95％以上；
 ②HPLC检测，反相柱(C₄、C₈、C₁₈等)或正相分子筛柱测得IL—2主峰占95％以上；
 (3)氨苄青霉素测定：因为大肠杆菌发酵的基因工程产品均采用氨苄青霉素抗性菌株生产，所以必须检定氨苄青霉素残余量；
 (4)残余DNA检测：采用同位素探针法，每剂残余DNA量不得超过100pg；
 还有生物制品要求的常规实验检定，如热原质测定、制剂水分测定、安全试验、急性毒性实验、无菌试验等均必须合格。
97．LAK细胞的杀肿瘤细胞作用：LAK细胞杀伤肿瘤细胞分如下三个阶段：
 (1)识别阶段：LAK细胞对正常细胞无损伤作用，而对肿瘤细胞结合进而杀伤，而且对多种肿瘤细胞结合而杀伤，说明多种肿瘤的细胞表面存在着共同抗原决定簇，可被LAK细胞所识别；正常细胞表面可能不存在肿瘤抗原决定簇，就不能被LAK细胞所杀伤；关于LAK细胞对肿瘤细胞结合分子特性研究发现了“淋巴因子活化细胞相关抗原”(LAA)，而用LAA制备了单克隆抗体(KBA MoAb)可以抑制LAK细胞杀伤活性，提示了LAK细胞杀伤肿瘤细胞的物质基础，从分子水平认识LAA抗原为两条链的糖蛋白组成的二聚体，LAA只存在受白介素—2激活后的细胞表面，说明LAA是白介素—2激活的细胞表面抗原标志，也说明LAK杀伤肿瘤细胞效应是白介素—2激恬的结果；
 (2)杀伤阶段：LAK细胞杀伤肿瘤细胞主要是通过细胞介导的细胞毒作用对肿瘤细胞的杀伤；LAK细胞内含有溶细胞颗粒(C．C)，该颗粒中含有一种穿孔蛋白质，所谓穿孔因子(Peffoin)；LAK细胞与肿瘤细胞结合时，LAK细胞发生极化，首先高尔基体向与肿瘤细胞接触点方向移动，通过微管将颗粒分泌到两种细胞接触面上，在Ca²⁺激活下，LAK细胞也释放一种肿瘤坏死因子样毒素，对肿瘤细胞作用慢，不需Ca²⁺，又称之为不依赖钙离子的杀伤作用，常常使肿瘤细胞DNA变性和细胞核裂解，从而抑制肿瘤细胞生长；
 (3)裂解阶段：瘤细胞受到攻击后，经上述两阶段后，完成裂解，抑制肿瘤生长。
98．集落刺激因子的功能：
  各种CSF的活性是以半固体培养基中CSF刺激造血细胞形成集落的能力来衡量的。其功能可分为四个方面：(1)刺激造血细胞增殖。集落形成细胞的分裂需要CSF持续存在，如从培养基中撤掉CSF，则细胞分裂停止，CSF的浓度决定细胞周期长短和产生子代细胞的总数目；(2)CSF既维系祖细胞的存活，也延长成熟细胞的寿命；(3)分化定型；(4)刺激终末细胞的功能活性。目前已知CSF能影响细胞作用、膜抗原的表达、吞噬作用、过氧化物的产生、杀伤微生物及肿瘤细胞，并产生许多重要的生物活性物质，如前列腺素E、肿瘤坏死因子、白细胞介素—1、丫干扰素、血纤溶酶原活化因子等。
99．C—CSF和GM—CSF的异同点：
  由于G—CSF和GM—CSF在许多相关的临床病例中可能有用，所以它们之间生物学特性差异，对某些疾病发病机理的认识有一定的意义；
 (1)C—CSF特异性刺激中性白细胞，而GM—CSF则是所有粒细胞的总刺激因子，例如若要通过提高嗜酸性效应细胞水平来治疗寄生虫感染，则GM—CSF作用比G—CSF为好；
 (2)GM—CSF是单核细胞和巨噬细胞的强激活剂，则G—CSF则不是，这种激活包括诱导产生诸如肿瘤坏死因子和IL—1类的其他细胞因子，如需提高单核细胞和巨噬细胞活性，可选用CM—CSF，而不是C—CSF；
 (3)CM—CSF是中性白细胞移动的强抑制剂，然而G—CSF则增强中性白细胞的移
动，例如当局部损伤时，GM—CSF可在局部产生，起弱的化学引诱剂作用，抑制炎症细胞离开炎症部位，而G—CSF则可增强炎症状细胞向炎症部位移动，这可能是两种造血生长因子共同提高宿主防御力的一种途径，在细菌性脓毒症时，接触内毒素可刺激单核细胞、巨噬细胞产生G—CSF，然后G—CSF刺激T细胞产生GM—CSF和IL—3，以增加骨髓内的骨髓细胞生成和进一步增强白细胞应答。
100．CSFs三种检测方法的特点：
 (1)生物活性检测法，特点是灵敏、方便，但因造血前体细胞、依赖株细胞一般都受几种因子的影响，因此，该法不能明确因子的特性；
质产物合成；
 (3)免疫学检测法，特点是特异、灵敏，
更高，缺点是不能证明有功能性蛋白缺点是不能证明被检CSF是否为具有
 (2)分子生物学检测法，特点是敏感性完整生物活性结构的蛋白质而非变性蛋白质，因此检测时最好将第一种与其他二种方法结合起来，就能明碗分辨CSF特性。
101．TNF的炎症活性：
  细胞因子在炎症反应中起着重要作用，参与炎症反应的调节因子一般分为两类：第一类主要参与早期炎症过程，如5—羟色胺、白三烯、前列腺素等。第二类主要调节炎症中各种相关细胞如淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、中性粒细胞、血小板的相互反应，并参加损伤后的修复过程，此类因子如TNF、CSFs、ILs，体内细胞因子在炎症的反应的顺序调节中TNF处于最起始的位置，TNF的分泌可引起其他因子如几—1，CSFs等的释放，而这些因子在机体炎症的起动，维持和消退中都起着重要使用，因此TNF是炎症反应的重要介质，在介导宿主的炎症反应，导致组织损伤方面的作用愈来愈引起人们的高度重视，TNF通过以下环节介导炎症反应：
 (1)TNF与内皮细胞：内皮细胞广泛分布于血管、腺体、体腔等处，作为多种组织的衬里细胞，它既是炎症的主要部位，也是参与炎症的主要组织，内皮细胞本身也是产生细胞因子的重要场所； ①TNF可改变内皮细胞的反应性，刺激血管生成，并刺激血管内皮细胞释放多种趋化因子，如ElAM—1和ICAM2促进炎症细胞的粘附特性，使内皮细胞与白细胞结合性增加，使之更易粘附于内皮细胞表面成为炎症反应中心； ②促进内皮细胞肿胀，通透性增强，使粘附的PMN渗出聚集并浸润炎症部位；③增强内皮细胞表面MHCI抗原的表达；④诱导内皮细胞产生几—1、CSF、PGE2等炎症介质，从而也加重炎症反应；⑤对内皮细胞的直接细胞毒作用；
 (2)TNF与血细胞：TNF诱导PMN局部浸润而启动炎症，TNF本身具有趋化活性，从血液中招募PMN以增强对有害因子的抵抗力，TNF通过增加PMN的吞噬功能及激活超氧化物阴离子的产生，从而使PMN更有效地对入侵物发生应答反应，一旦免疫过程启动，TNF即诱导氧化爆发、脱粒和提高吞噬活性；
 (3)TNF诱导成纤维细胞生长并生产几—1、CSF及PGE2等加重炎症反应，与几—1协同引起包括凝血在内的二系列血管炎症反应；
 (4)介导内毒素休克：TNF的一种基本作用是介导内毒素休克，用抗TNF抗体可减弱机体内毒素致命的病理作用，现在认为细菌本身不是导致内毒素休克的决定因素，因细菌侵入宿主后所释放的TNF等细胞因子可能更起到重要作用；
 总之，TNF为一种重要的炎症介质，具有强烈的致炎活性，在炎症反应、内毒素休克及组织损伤等过程中起着重要作用。
102．EP0的生物体外测定法：
 根据可以刺激定向幼红细胞集落形成细胞(CFU—E)形成的原理，把骨髓、脾脏、胎肝中的红系原祖细胞分离出来，与EPO一起培养，然后加入同位素标记物³H—TdR、⁵⁹Fe—Heme，在EP0刺激下，红细胞生长分化进入活跃状态，并使同位素标记物掺人细胞内的速率明显增加，通过测定细胞的放射活性，可间接推算出血EPO浓度、此法在准确性、敏感性、简便性等方面比体内法好，但它仍属间接测定法，易受待测血清中非特异性因子的干扰。
 

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