复习资料：2019年1月自考《生物制药技术》重点串讲六

1．重组DNA技术通常包括：
（1）基因重组载体的选择和制备；（2）目的基因的分离纯化；（3）目的基因与载体的重组；（4）重组克隆的转化与感染；（5）重组克隆的筛选与鉴定；（6）目的基因的表达及表达产物的分离与提纯；
2．载体的基本条件：
（1）本身是一个复制子，能自我复制；（2）分子量要小；（3）带选择标记，以便进入宿主细胞后有可辨认的表型特征；（4）对几种限制性酶有单一切点：（5）有一定的非必要区，在这段插入外源基因不影响其复制。
3．可作为载体的有：
（1）质粒；（2）λ噬菌体；（3）M13噬菌体；（4）科斯质粒；（5）动、植物病毒。
4．选择裂解细菌的方法取决于：
（1）质粒的大小；（2）大肠杆菌菌株；（3）裂解后用于纯化质粒DNA的技术；
5．选择裂解细胞的一般准则：
（1）大质粒（大于15Kb）易受损，故应采用温和裂解法（SDS裂解法）从细胞中释放出来；
（2）对于小质粒，可加入EDTA后采用溶菌酶处理，再通过煮沸或碱处理使之裂解。
6．λ噬菌体作为克隆载体的特点是：
（1）λ噬菌体可在体外包装成病毒颗粒，高效地转染大肠杆菌；（2）λDNA的长度只有在野生λ噬菌体的75%-105%之间才能够包装；（3）λ噬菌体适于克隆大片段DNA及组建基因文库。
7．科斯质粒的特点是：
（1）具有λ噬菌体的特性，能高效地转染宿主细胞，但它不含λ噬菌体的全部必要基因，不能裂解生成噬菌斑；（2）具有质粒载体的特性，带有质粒的抗性基因而易于筛选。
8．M13载体的优点：
（1）单链DNA噬菌体的复制，是以双链DNA库间媒介；利于体外纯化；（2）不论单链DNA还是双链复制形式DNA均能够感染大肠杆菌；（3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多制约，而不存在包装限制问题；（4）可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。
9．T₄DNA连接酶的作用机制：
（1）T₄DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-AMP复合物；（2）酶-AMP复合物再结合到具有5^，一磷酸基与3^，羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。（3）产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
10．DNA连接反应中的注意事项：
（1）连接及反应温度；（2）防止粘末端的自身环化应采取以下措施：①控制载体与外源DNA分子的浓度与比例；②用碱性磷酸酶处理载体防止自身环化；③定向克隆；（3）用λDNA和科斯质粒的载体时的连接；①λDNA载体应考虑两个参数：插入分子左右臂的比例，两者的浓度；②科斯质粒常用两种方法连接，一种是用碱性磷酸酶处理，另一种是多酶反应进行的克隆。
11．受体细胞一般具有的性能：
（1）有接受外源DNA的能力；（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷型；（3）DNA重组缺陷型；（4）不适于在非培养条件下生存。
12．DNA分子转化机理：
（1）吸附：完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面；（2）转入：双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一链降解；（3）自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA（4）表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。
13．基因表达的三个基本条件：
（1）基因的密码区不能被插入序列所中断；（2）基因必须在启动子控制之下；（3）mRNA必须相当稳定并有效转译，产生的外源蛋白不被宿主很快降解。
14．碱裂解法制备质粒DNA的方法：
（1）接种菌落于含抗生素的LB中，37⁰C剧烈振荡反应；（2）培养液4⁰C12000rpm30min离心；（3）重悬细菌于100μl冰预冷的溶液I（50mM葡萄糖，25mMTris-HCL(pH8.0),10mM EDTA Ph8.0）中剧烈振荡；（4）加200μl亲配制液溶液II（0.2M NaOH1%SDS）,混合内容物，不要振荡，置冰上；（5）加150μl冰预冷溶液III（5M Kac60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml），温和振荡10s置于阔步3-5min；（6）4⁰C。12000rpm离心5min，转移上清；（7）上清加等量酚；氯仿抽提，4⁰C，12000rpm离心2min，收集上清；（8）加入2倍体积乙醇，振荡混合，室温放置2min；（9）4⁰C，12000rpm，离心5min，弃上清；（10）倒置离心管，倾干液体；（11）1ml70%乙醇4⁰C洗涤沉淀，弃上清，空气中干燥10min；（12）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮于-20⁰C。
15．配制工业发酵培养基的一般要求：（1）营养物质的组成比较丰富，浓度恰当，能满蹉力种发芽和生长繁殖成大量的有生理功能的菌丝体之需要；（2）在一定条件下，所采用的原料彼此之间不发生化学反应，理化性质相对稳定；
（3）粘度适中，最有适当的渗透压；（4）要考虑所采用的原材料的品种和浓度，与代谢产物生物合成过程中的调节关系；（5）生产过程中，既不影响通气与搅拌的效果，又不影响产物的分离，精制，以及废物的处理。（6）原材料尽量做到因地制宜，质优价廉，成本低。
16．培养基的配制原则：1）营养成分配制原则：2）营养成分配比应恰当；（3）渗透压应合适；（34）pH值应合适；（5）氧化还原电位需符合要求。
17．工业微生物筛选一般要求：（1）稳定而高产的遗传特性；（2）抗噬菌体能力强；（3）发酵过程泡沫少；（4）需氧量低；（5）底物转化率高；（6）对培养基和前体耐受力强；（7）营养特性；（8）最适温度高；（9）菌种既要高的遗传稳定性，又要有基因操作的可修饰性；（10）产物微生物常用的分离筛选途径：
18．工业微生物常用的分离筛选途径：（1）从菌种保存机构的已知菌种中分离；（2）从自然界中分离筛选；（3）从生产过程中分离筛选。
19．单孢子悬液的制备方法：（1）对于细菌，因其在固体斜面培养基上常粘在一起，故要求转接到新鲜肉汤液体中进行培养，以取笪分散且生长活跃的菌体；（2）对放线菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后，用滤纸或棉花过滤。
20．原生质体融合技术的特点：（1）打破物种界限，可实现远缘杂交；（2）可实现两上以上同种或不同种微生物细胞融合；（3）原生质体易于受到诱变剂的作用而成为较好的诱变对象；（4）可使重组频率大大提高。
21．微生物菌种保存方法：（1）斜面低温保藏法；（2）液体石蜡封存法；（3）沙土管保存法；（4）冷冻干燥保存法；（5）超低温保藏法。
22．工业微生物表面培养法的优缺点：（1）优点：①简单易行；②投资少；③适于小型生产（2）缺点：①劳动强度大；②占地面积大；③产量低；④易污染。
23．工业发酵中提高发酵液的溶氧水平的措施：（1）提高通气强度；（2）增加搅拌转速；（3）增加罐压；（4）增加挡板；（5）通气中掺入纯氧；（6）控制基质培养基；（7）控制补料率；（8）调节温度；（9）添加表面活性剂；（10）中间补水；11）液化培养基。
24．影响微生物原生质体制备的因素：1）菌体的预处理；（2）菌体的培养时间；3）酶浓度；（4）酶解温度；（5）酶解时间；（6）渗透压稳定剂。
25．微生物工程产品主要类型：（1）微生物菌体；（2）初级代谢物；（3）次级代谢物；（4）生物活性大分子；
26．微生物工程在医药工业中的应用：（1）抗生素类；（2）氨基酸类；（3）核苷酸类；（4）维生素类；（5）甾体类激素；（6）治疗酶及酶抑制剂。
27．植物细胞培养的特性：（1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁，细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；（2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）细胞生长的中期及对数期，易凝聚成团块，悬浮培养较难；（4）培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；（5）具有群体效应，无锚地依赖性及接触抑制性；（6）培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低；（7）培养过程具有结构与功能全能性。
28．种质保存意义：（1）植物组织及细胞移植继代培养过程可能导师致染色体及基因型变异；2）森林及土地无止尽开发利用，自然种质库破坏，需建产人工种质库；（3）细胞工程中获得的中草药及农作物优良品种的特殊变异细胞及杂种细胞，常规保存法易于变异，需进行种质资源广泛收集与长期保存；（4）细胞培养建立的人工种质库可节省土地与劳务。
29．植物原生质体制备的预处理方法：（1）预质壁分离；（2）预培养；（3）暗处理；（4）光处理；（5）低温处理；
30．植物细胞生长所需的营养成份：H₂O、无机营养物、维生素、碳源、天然物、植物激素、氨基酸类、核酸及其水解物以及其它成分。

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